Variante 3’UTR 14bp del/ins

Introduzione  

L’antigene HLA-G è una molecola non-classica HLA di classe I caratterizzata da (i) un basso polimorfismo allelico, (ii) una ristretta distribuzione tessutale, (iii) un differente splicing dell’mRNA che genera sette isoforme proteiche e (iv) una possibile funzione biologica nell’induzione della tolleranza verso il “non self” ed antiinfiammatoria [1-3]. Il gene HLA-G si trova sul cromosoma 6 (6p21.3) e mostra un basso polimorfismo allelico rispetto agli altri HLA di classe I, con 36 alleli descritti nella regione codificante (http//:www.anthonynolan.org.uk/HIG). Le regioni più polimorfiche del gene sono nella regione di regolazione 5’ (5’UTR) e la regione 3’ non tradotta(3’UTR) che possono contribuire alla regolazione dell’espressione di HLA-G [4]. Un polimorfismo di inserzione/delezione di 14 bp (rs16375) in 3’UTR dell’esone 8 è stato correlato alla stabilità dell’mRNA e dalla quantità della proteina HLA-G [5,6]. L’allele con un’inserzione di 14 bp è stato associato a livelli d’espressione di HLA-G più bassi rispetto all’allele con la delezione di 14bp [6,7]. Diversamente dagli antigeni HLA di I classe, le sette isoforme HLA-G sono generate da splicing diversi del loro trascritto primario. Quattro di queste, HLA-G1 -G2, -G3 e -G4, sono forme legate alla membrana, mentre tre, HLA-G5,-G6 e -G7 sono molecole solubili. Le isoforme solubili contengono l’introne 4 che include un codone di stop ed anticipa l’arresto della traduzione dell’mRNA prima del dominio transmembrana. Le isoforme maggiormente analizzate sono l’HLA-G 1 di membrana e in forma solubile, ottenuta con taglio proteolitico, e la forma solubile HLA-G5 [8]. Nelle tecniche odierne di riproduzione in vitro, l’impianto dell’embrione rimane un evento complesso e poco conosciuto. La maggioranza degli embrioni trasferiti non si impianta (> 70%) e solo una minoranza (circa 14%) darà luogo ad una gravidanza a termine. Oggi la selezione dell’embrione da trasferire si basa per la maggior parte su criteri morfologici e di divisione cellulare. Articoli scientifici recenti hanno riportato l’importanza di alcune molecole nella regolazione dello sviluppo dell’embrione prima dell’impianto e sull’impianto stesso. Un possibile marker sembra essere la proteina sHLA-G (HLA-G solubile) (9). sHLA-G è stata trovata nel supernatante di colture di embrioni umani ottenuti tramite IVF; in particolare uno studio eseguito su 101 pazienti ha dimostrato che la presenza di questa proteina secreta dall’embrione è un prerequisito obbligatorio, benché non da solo sufficiente, per l’istaurarsi e il procedere della gravidanza. Infatti, una gravidanza clinica è stata ottenuta solo se sHLA-G era presente nel supernatante dell’embrione in coltura al giorno del transfer (10). Inoltre, una scarsa espressione disHLA-G da parte della madre, è stata associata con pre-eclampsia, aborti spontanei ricorrenti e fallimenti delle terapie IVF (11-13). La concentrazione della proteina sHLA-G rilasciata dall’embrione e anche quella prodotta dalla mamma dipende in gran parte dal genotipo del gene HLA-G. In particolar modo da alcune varianti che alterano l’espressione del gene e /o che causano una degradazione maggiore del trascritto. Le differenze nella concentrazione di HLA-G sono quindi in buona parte determinabili dall’analisi del gene HLA-G (6,7,12). Nel quadro della diagnostica di infertilità di coppia, poiché il genotipo dell’embrione dipende sia dal padre che dalla madre, per stimare le potenzialità dell’embrione a produrre la proteina sHLA-G, l’analisi delle varianti sul gene HLA-G viene eseguita su entrambi i partners. 

 

Scopo dell’analisi 

  1. Indagine tramite test genetico molecolare della varianti 3’UTR del/ins 14 bp sul geneHLA-G in caso di ripetuti fallimenti dei trattamenti IVF o di aborti spontanei ricorrenti idiopatici.
  2. In caso di inseminazione eterologa, analisi eseguita sulla paziente per la scelta di un donatore con genotipo HLA-G compatibile con al paziente.

 

Quando viene richiesta l’analisi 

L’analisi viene richiesta sui due partners nelle seguenti situazioni:

  • Ripetuti fallimenti della terapia IVF
  • Aborti spontanei ricorrenti idiopatici

L’analisi viene proposta unicamente alla paziente in caso di:

  • Inseminazione eterologa, per la scelta del donatore

  

Informazioni generali sul test 

Il DNA genomico viene estratto seguendo un protocollo standard e viene eseguita una reazione di polimerizzazione a catena (PCR) per amplificare il frammento di interesse. La variante 3’UTR 14 bp ins/del viene amplificata tramite PCR fluorescente (un primer marcato) e inseguito analizzata tramite Analisi di Frammento su Genetic Analyzer.

 

Significato clinico

In base al risultato dell’ analisi eseguita, e alla storia clinica del paziente, il medico può decidere quale sia la terapia più indicata da utilizzare.

 

Analitica:

Prelievo: 5 ml sangue EDTA

Tempi: 10 giorni lavorativi

 

 Bibliografia e Linee Guida 

1. Carosella ED, Moreau P, Lemaoult J, Rouas-Freiss N. HLA-G: from biology to clinical benefits.Trends Immunol. 29(3), 125-132 (2008).2. Le Bouteiller P, Solier C. Is antigen presentation the primary function of HLA-G? Microbes Infect.3(4), 323-332 (2001).3. Bainbridge D, Ellis S, Le Bouteiller P, Sargent I. HLA-G remains a mystery. Trends Immunol.22(10),548-552 (2001).4. Hviid TV, Rizzo R, Melchiorri L, Stignani M, Baricordi OR.Polymorphism in the 5’ upstream regulatoryand 3’ untranslated regions of the HLA-G gene in relation to soluble HLA-G and IL-10 expression.Hum. Immunol. 67, 53–62 (2006).5. Hviid TV, Hylenius S, Rørbye C, Nielsen LG. HLA-G allelic variants are associated with differences inthe HLA-G mRNA isoform profile and HLA-G mRNA levels. Immunogenetics 55, 63–79 (2003).6. Chen XY et al., The 14 bp deletion polymorphisms in HLA-G gene play an important role in theexpression of soluble HLA-G in plasma. Tissue Antigens 72, 335-341 (2008)7. Rousseau P, Le Discorde M, Mouillot G, Marcou C, Carosella ED, Moreau P. The 14 bp deletioninsertionpolymorphism in the 3′ UT region of the HLA-G gene influences HLA-G mRNA stability.Hum. Immunol. 64(11), 1005-1010 (2003).8. Dong Y, Lieskovska J, Kedrin D, Porcelli S, Mandelboim O, Bushkin Y. Soluble nonclassical HLAgenerated by the metalloproteinase pathway. Hum. Immunol. 64, 802-810 (2003).9. Roussev RG, Coulam CB, HLA-G and its role in implantation. J. Assist Reprod Genet 24, 288-295(2007) 10. Fuzzi B et al, HLA-G expression in early embryos is a fundamental prerequisite for the obtainment ofpregnancy. Eur. J. Immunol. 32, 311-315 (2002)11. Moreau P et al. HLA-G gene polymorphism in human placenta. Biology of Reproduction 79, 459-467(2008)12. Ober C et al, Variation in the HLA-G Promoter Region Influences Miscarriage Rates. Am. J. Hum.Genet. 72, 1425-1435 (2003)13. Hviid TV et al, HLA_G polymorphism in couples with recurrent spontaneous abortions. TissueAntigens 60, 122-132 (2002).

La proteina HLA-G riveste un ruolo molto importante nella tolleranza immunologica delle mamma nei confronti del feto.